小鼠精子发生相关3基因剪接变异Spata3变体4的RG-003分子克隆( RG-003 Molecular clone of Spata3 variant 4, a novel splice variant of mouse spermatogenesis associated 3 gene (Spata3) )

L Li GX Lu G Liu JJ Fu

引言：睾丸生殖细胞凋亡存在于整个精子发生过程中，受多种基因调控。观察到无精少精不孕患者睾丸生殖细胞凋亡异常增多。发现与睾丸生殖细胞凋亡相关的新基因，对于进一步了解精子发生的生理和病理机制具有重要意义。Mtsarg1(Mus musmusculus睾丸和精子发生细胞凋亡相关基因1)(GenBank登录号AF399971,同义词:Spata3)全长1103 bp。在本研究中，作者在克隆Mtsarg1的过程中鉴定了一个新的Spata3变异体4（简称Spata3-v4,GenBank登录号EU259321和EF546784),该变异体长度为3887 bp。材料/方法：从成年DBA/2和BALB/c小鼠新鲜睾丸中分离总RNA，然后进行RT-PCR。以Advantage 2 DNA聚合酶（Clontech）和DBA/2或BALB/c小鼠睾丸cDNA为模板，在Mtsarg1的开放阅读框(ORF)两侧设计PCR引物(A1、A2),克隆Mtsarg1和Spata3-v4的ORF,用于转基因表达。根据Mtsarg1的全长设计引物(B1、B2)用于PCR检测，克隆了Spata3-v4和Mtsarg1的全长。将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，分别进行测序。采用RT-PCR和northern印迹对8种DBA/2小鼠组织进行分析。用地高辛标记的寡核苷酸探针在石蜡包埋的DBA/2小鼠睾丸组织切片上进行原位杂交。构建pEGFP-C2/mtSARG1或pEGFP-C2/Spata3-v4重组质粒，用脂质体β2000转染小鼠GC-1 spg细胞或COS-7细胞，转染24h后在荧光显微镜下观察。结果:Spata3-v4与Mtsarg1在DBA/2和BALB/c小鼠睾丸中表达。在2%琼脂糖凝胶电泳的RTPCR产物上，除出现一条609bp的Mtsarg1对应带外，还出现一条449bp的Spata3-v4对应带。Spata3-v4全长887 bp,与Mtsarg1相同，但缺少Mtsarg1的第二外显子。它们都映射到小鼠染色体1C5上。Spata3-v4包含3个外显子，其ORF为417 bp，编码一个由138个氨基酸组成的蛋白质，与MTSARG1共有100个N端氨基酸。Spata3-v4蛋白是一种非分泌性蛋白，其理论分子量为14.79kDa，等电点为9.74。多组织RT-PCR和northern blot结果提示Spata3-v4和Mtsarg1 mRNA仅在睾丸中高水平表达。原位杂交表明，Mtsarg1和Spata3-v4 mRNA主要表达于小鼠精母细胞。亚细胞定位研究表明，EGFP标记的Spata3-v4蛋白定位于GC-1、spg细胞和COS-7细胞的胞浆内，Mtsarg1蛋白主要定位于细胞核内。结论：我们报告Spata3变体4，一种新的Spata3转录变体。Spata3-v4和Mtsarg1具有睾丸特异性，可能在小鼠睾丸精子发生或细胞凋亡中发挥重要作用。

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