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通过体内单链DNA生产的高通量功能性变异筛选( High throughput functional variant screens via in-vivo production of single-stranded DNA )
MG Schubert DB Goodman TM Wannier D Kaur GM Church
自然界中存在着巨大的遗传变异，但我们创造和表征单个遗传变异的能力在规模上仍然有限得多。同样，工程蛋白质和表型需要引入合成变体，但变体的设计超过了变体效应的实验测量。在这里，我们优化高效和连续产生精确的基因组编辑在大肠杆菌中，通过在体内生产单链DNA的逆转录活性。使用该方法可以获得90%以上的编辑效率，实现多路应用。我们介绍了Retron文库重组(RLR)，这是一个用于高通量筛选变异体的系统，其中引入的编辑与它们的Retron元件的关联能够实现有针对性的深度测序表型输出。我们使用RLR对合成的变异体进行汇集、定量表型分析，表征抗生素耐药性等位基因。我们还使用一种进化细菌的剪切基因组DNA，通过实验查询数百万个抗生素耐药性变异的序列来进行RLR。通过这样做，我们证明了RLR是唯一适合于利用非设计的变异源。因此，使用体内产生的ssDNA的联合实验为探索整个基因组的变异提供了新的途径，无论是设计的还是非设计的。
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