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基于新型大肠杆菌载体的高效分子生物学操作改进策略( Efficient Molecular Biological Manipulations with Improved Strategies Based on Novel Escherichia coli Vectors )
Y Zhang H Gao X Qi S Gao Y An temperature-sensitive promoter TA cloning IPTG-induced protein expression intein ELP
在本研究中，一些新的质粒被构建为灵活和零背景的分子克隆，更有效的表达和蛋白质纯化的改进策略。质粒pANY4-pL18-ccdB和pany4-PR18/PL18-CCDB在互补DNA链上具有不同的启动子。因此，无论是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的还是温度诱导的蛋白表达的重组质粒都可以在单分子克隆过程中同时构建，以进行平行比较。耐人寻味的是，突变的pL18和PR18/pL18启动子在促进GFP或pfLamA酶的表达时，与T7启动子相似，甚至更好。构建了含His-ellastin-like polypeptide(ELP)intein多功能标签的质粒pANY8，并设计了特殊的纯化方案，无需费时的透析步骤去除咪唑和高浓度的盐离子，即可获得纯化蛋白。此外，尿素基变性和复性过程可以方便地集成到ELP介导的沉淀方案中，以纯化不溶性包涵体，省去了耗时的透析步骤。
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