10纳克总RNA的单读和配对末端mRNA-Seq Illumina文库

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作者：scidown 发布时间：2021-06-16 21:52:02 文章标题：

10纳克总RNA的单读和配对末端mRNA-Seq Illumina文库( Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA )

文章作者：

S Sengupta JM Bolin V Ruotti KN Bao JA Thomson AL Elwell R Stewart Molecular Biology Issue 56 Genetics mRNA-Seq Illumina-Seq gene expression profiling high throughput sequencing

文章简述：

利用mRNA-Seq进行全转录组测序已被广泛应用于基因表达、突变、等位基因特异性表达等全基因组分析。mRNA-Seq甚至为未测序基因组的基因表达分析打开了大门。mRNA-Seq提供高灵敏度、大动态范围，并允许测量样本中转录本拷贝数。Illumina的基因组分析仪对大量(>107)相对较短的序列读数(<150 bp）进行测序。“配对端”方法，其中一个长读数在其两端进行测序，允许跟踪交替的剪接连接、插入和缺失，并且对从头开始的转录组组装有用。研究人员面临的主要挑战之一是起始材料的数量有限。例如，在通过激光显微切割收获细胞的实验中，可用的起始总RNA可以以纳克为单位测量。已经描述了从这些样品制备mRNA-Seq文库1、2，但涉及可能引入偏倚的显著PCR扩增。在此，我们描述了一种Illumina Genome Analyzer II平台用于mRNA-Seq测序的文库制备的方案，该方案避免了显著的PCR扩增，并且仅需要10纳克的总RNA。虽然这个协议已经在前面描述过，并且被证实用于单端测序5（在那里它被证明产生定向文库而不引入显著的扩增偏置），但是在这里我们进一步验证它作为配对端协议的使用。我们使用基于T7的Eberwine线性扩增方法（被称为“T7LA”(T7线性扩增）从起始总RNA中选择性地扩增多腺苷酸化的信使RNA。将扩增的poly-A mRNAs进行片段化、逆转录和连接，得到最终的测序文库。对于单次读取和成对的结束运行，序列被映射到人类转录体6并被归一化，以便可以比较来自多次运行的数据。我们报告了以每百万转录本单位(TPM)为单位的基因表达测量，在比较样品时，这是比RPKM更优越的测量7。

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