肝癌是严重危害人类健康的一种常见恶性肿瘤,并已成为最难治疗的恶性肿瘤之一,迫切需要研究和发展新的治疗方案,以期有效控制其术后复发,提高中晚期肝癌患者的生存水平.随着分子生物学和基因工程技术的发展,基因治疗已被认为是一种最有希望的治疗方案之一,基因治疗的首要问题是将治疗基因输送到并使其进入特定的靶细胞,如何构建安全有效的胞内基因传输系统,不仅是分子生物学研究的热点之一,也为药剂学的研究开辟了一个新的领域. 目前在基因治疗中普遍使用的传输系统有两类:病毒载体和非病毒载体.但病毒载体有可致病毒感染,激活癌基因及自身免疫反应等缺点,非病毒载体则克服了这些缺点,其中研究得较为广泛的是阳离子脂质体.阳离子脂质体因带正电荷容易与荷负电的细胞发生作用,成分也与细胞膜类似,又被称为"融合"脂质体,其体外转染效果好,但体内应用时易与血浆中的成分(如血浆蛋白)结合,生成聚集体在肺部引起肺栓塞.近年来,带有二硫键的脂质体骨架材料如CHETA([2-[[4-[(羧甲基)二硫]-1-亚氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸胆固醇酯,C_(36)H_(61)N_3O_4S_2)倍受研究者们的重视.由于胞膜和胞浆中存在可使二硫键还原的硫氧还蛋白还原酶和蛋白二硫异构酶,这种带有二硫键的材料制成的前阳离子脂质体更加有利于所载药物的细胞内传递.CHETA的骨架可用X-Y-S-S-Z的结构来简单表示,X为疏水基,Y-S-S-Z为亲水基,其中,Y带正电荷,Z带负电荷,这两部分通过二硫键相连,在生理pH条件下,整体带负电荷或显中性.当此材料制备的脂质体到达细胞表面时,其中的二硫键被存在于细胞膜上的硫氧还蛋白还原酶和蛋白二硫异构酶还原,使带负电荷的Z基被去掉而转变为阳离子脂质体(X-Y~+-S-S-Z~-→X-Y~+-SH+HS-Z~-).这种前阳离子脂质体既利用了阳离子脂质体易与细胞融合的优点,又克服了其在体循环中易与血浆中的成分相结合等弱点,是一种非常有潜力的载体系统,但存在无靶向性且载药量低的缺点. 为了实现细胞的定向输送,近年一般采用受体介导的主动靶向,如肝实质细胞膜上存在去唾液酸糖蛋白受体,转铁蛋白受体;非实质细胞膜上分布有甘露糖受体,低密度脂蛋白受体等,根据谢天培,吴孟超等的研究结果,肝癌组织中转铁蛋白受体的含量高于癌旁及正常肝组织.因此,通过转铁蛋白有可能提高肝癌细胞对前阳离子脂质体的摄取效率. 本研究利用带有二硫键的脂质体骨架材料CHETA,构建了"前阳离子"脂质体用于包裹经鱼精蛋白缩合后的质粒DNA,以LacZ和EGFP为报告基因,以HSV-TK基因为模型药物,以转铁蛋白为配体,制备转铁蛋白修饰的前阳离子脂质体. 利用微生物发酵的方法大量培养转化有质粒的大肠杆菌,并采用阴离子柱层析的方法分离纯化质粒.采用紫外分光光度法和凝胶电泳法对质粒的纯度和含量进行了测定,纯度符合要求. 化学合成带有二硫键的胆固醇衍生物CHETA,然后通过薄膜超声分散法制备空白前阳离子脂质体;以鱼精蛋白缩合质粒DNA,再与空白前阳离子脂质体作用形成载基因前阳离子脂质体(PLPD);转铁蛋白(Transferrin,TD与PLPD作用形成转铁蛋白修饰的载基因前阳离子脂质体(Tf-PLPD);在单因素法实验的基础上利用中心组合设计法优化前阳离子脂质体的处方.结果所制得的PLPD形态近似于球体,平均粒径为228.9±8nm,多分散指数为0.150±0.030(n=3),Zeta电位为-25.08±2.5 mV(n=3);Tf-PLPD平均粒径为240±12nm,多分散指数为0.150±0.030;Zeta电位-24.10±2.5 mV(n=3). 为了提高前阳离子脂质体的物理化学及生物学稳定性,本课题将其制备成冻干针剂.冻干后的前阳离子脂质体可以保持其结构的完整性,针剂外观饱满疏松,色泽均匀,表面细腻光洁,具有足够的强度;其粒径和Zeta电位及微粒的形态和pH值无明显改变,而且再分散性良好.另外,前阳离子脂质体经冻干后能保持其转染活性和抗核酸酶能力. 在体外细胞的转染实验中,以易于检测的LacZ和EGFP报告基因为工具,对所构建的前阳离子脂质体在体外细胞中的表达效率与裸DNA,阳离子型脂质体LPD进行了比较研究.以LacZ为报告基因,结果表明PLPD的转染效率不及Tf-PLPD,PLPD的转染效率为12.18±3.8 mUβ-galactosidase/mg protein,Tf-PLPD的转染效率为24.26±2.6 mUβ-galactosidase/mg protein,是裸质粒的20倍;前阳离子脂质体在大鼠血清中较稳定,胎牛血清的存在严重抑制阳离子型脂质体LPD的转染效率,但PLPD和Tf-PLPD的转染效率不受影响;在没有血清存在时,Tf-PLPD的转染效果与阳离子型脂质体LPD相当;在有血清存在时,Tf-PLPD的转染效果大于LPD.PLPD和Tf-PLPD小于阳离子型脂质体LPD对人肝癌细胞HepG2,SMMC7721和张氏正常肝细胞三种细胞株的毒性.以EGFP为报告基因,转染效率得到相似的结果;并且,前阳离子脂质体转运TK基因联合更昔洛韦用药,显示出明显的细胞抑制效应和旁观者效应. 综上所述,本研究构建的转铁蛋白修饰的载基因前阳离子脂质体具有以下三个优点:1,体外转染效率与阳离子脂质体相当,优于裸质粒;2,细胞毒性小于阳离子脂质体;3,转染效率不受血清的影响;4,可做成冻干制剂长期保存等.这种前阳离子脂质体既利用了阳离子脂质体易与细胞融合的优点,又克服了其在体循环中与血浆中的成分相结合等弱点,是一种非常有潜力的载体系统.
