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全自动筛选组合文库以避免假阳性:应用于破伤风类毒素配体鉴定( Fully Automated Screening of a Combinatorial Library to Avoid False Positives: Application to Tetanus Toxoid Ligand Identification )
María C. Martínez Ceron Lucía vila Silvana L. Giudicessi Juan M. Minoia Osvaldo Cascone
肽配体广泛应用于亲和层析纯化蛋白质。在此，我们应用了一种避免假阳性肽珠选择的全自动两阶段文库筛选方法，并将其应用于破伤风类毒素纯化。第一个文库筛选只使用磺胺嘧啶（一种荧光染料），并用流式细胞术自动分离荧光珠并丢弃。然后用目标蛋白（破伤风类毒素）-罗丹明结合物与文库的其余部分进行第二次筛选。此次分离荧光珠，采用基质辅助激光解吸/电离串联质谱技术鉴定肽序列。合成了出现频率较高的化合物，并将其固定在琼脂糖上，以评价一系列色谱纯化条件。亲和基质PTX1-琼脂糖（AC-Leu-Arg-Val-Tyr-His-Gly-Gly-Ala-Gly-Lys-琼脂糖）在20 mM磷酸钠、0.05%吐温20、pH5.9的吸附缓冲液和100 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、pH8.0的洗脱缓冲液中表现最佳。将纯破伤风类毒素(Ttx)装于PTx1基质色谱柱上，吸附率达96%,Kd为9.18±0.07nmol/L,qm为1.31±0.029μmolTTX/ml基质。接下来，用甲醛处理的破伤风梭菌培养上清（以获得类毒素）作为样品。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示一条带，经电喷雾质谱鉴定为Ttx，该带仅出现在洗脱馏分中，在洗脱馏分中还检测到S层蛋白。
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