端粒酶重复扩增协议(TRAP)( Telomerase Repeated Amplification Protocol (TRAP) )

I Mender JW Shay Replicative senescence 复制性衰老 Telomeres 端粒 Cancer 癌症 Stem cells 干细胞 PCR PCR

端粒位于真核线形染色体的末端，与端粒结合的蛋白质保护DNA不被认为是双链断裂，从而防止端到端融合（Griffith et al.，1999)。然而，由于末端复制问题和氧化损伤等其他因素，培养细胞的有限寿命（Hayflick极限）导致这些保护性结构逐渐缩短（Hayflick and Moorhead，1961；Olovnikov，1973)。核糖核蛋白酶复合物端粒酶--由蛋白质催化成分hTERT和功能性RNA成分hTR或hTERC组成--通过在大约90%的人类原发性肿瘤和一些短暂增殖的干细胞染色体末端增加端粒重复来抵消端粒缩短（Shay and Wright,1996；Shay and Wright,2001）。这导致细胞持续增殖，这是癌症的标志。因此，端粒生物学在衰老、癌症进展/转移以及靶向癌症治疗中起着核心作用。端粒生物学中常用的方法有端粒限制性片段(TRF)（Mender and Shay，2015b)、端粒重复序列扩增(TRAP)和端粒功能障碍诱导灶(TIF)分析（Mender and Shay，2015a)。在这个详细的协议中，我们描述了端粒重复扩增协议(TRAP)。TRAP法是测定哺乳动物细胞和组织样本中端粒酶活性的常用方法（Kim et al.，1994)。TRAP分析包括三个步骤：延伸、扩增和端粒酶产物的检测。在延伸步骤中，端粒重复被端粒酶添加到端粒酶底物（实际上是非端粒寡核苷酸，TS)上。在扩增步骤中，用特异引物（上游TS引物和下游ACX引物）通过聚合酶链反应(PCR)扩增延伸产物；在检测步骤中，通过电泳分析端粒酶的存在与否。TSNT为内标对照，经TS引物扩增。NT是其自身的反向引物，不是端粒酶的底物。这些引物用于通过凝胶是否缺乏内部对照条带来识别假阴性结果。

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