酵母杂交系统在CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶率研究中的应用

毕博 张宇 赵慧 脱靶效应 酵母双杂交 CRISPR/Cas9系统

目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值.方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率.随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响.首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A,B,C,D,E,F,G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5,pHZ7,pHZ9,pHZ11,pHZ13,pHZ15,pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6,pHZ8,pHZ10,pHZ12,pHZ14,pHZ16,pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20.随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率.结果:酵母培养144～192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低.根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20%,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20%～28%.结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比.sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性.两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值.

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