科学支持在线教材10.1126/ Science .1085162食品及化妆品植物色素碧桃的生物合成( Science Supporting Online Materia 10.1126/science.1085162 Biosynthesis of the food and cosmetic plant pigment bixin (annatto) )

F Bouvier O Dogbo B Camara

5μm FeSO4、0.2%辛基-β-葡萄糖苷、1 mM DTT、50μm番茄红素、β-胡萝卜素或玉米黄质用于BOLCD；2 mM NAD+、0.2%辛基-β-葡萄糖苷、50μm比欣醛（用于BoBADH）和1 mM S-腺苷甲硫氨酸、50mM KCl、1 mM DTT、5%二甲基亚砜、50μm诺必欣（用于Bonbmt）。以含有空载体对照的大肠杆菌粗提物或煮沸的BoLCD、BoBADH和BonBMT作为对照。BoLCD用700μL乙醇：二氯甲烷（1：1）和旋涡停止反应，BoBADH和BonBMT在萃取前用2%醋酸猝灭反应。二氯甲烷相采用高效液相色谱仪，用二极管阵列分析光谱和Zorbax C18反相柱(4.6mm×25cm)(S1)进行。对BoLCD活性的HPLC程序包括：乙腈（0-5分钟），乙腈与100%二氯甲烷的线性梯度（5-20分钟），二氯甲烷（20-25分钟）和二氯甲烷与100%乙腈的线性梯度（25-30分钟），流速为每分钟1毫升（方法I）。对于BoBADH和BonBMT的活性，HPLC程序包括：乙腈：2%乙酸（70：30）（0-5分钟），乙腈与100%二氯甲烷的线性梯度（5-20分钟），二氯甲烷（20-25分钟）和二氯甲烷与100%乙腈：2%乙酸的线性梯度（25-30分钟），流速为每分钟1毫升（方法II）。或者，用已烷：丙酮（60：40）展开的硅胶板通过薄层色谱分析产物，如前面所述(S1)。用Trio 2000质谱仪（Micromass）对反应产物进行质谱分析，如S1)所述。为了在大肠杆菌中进行bixin的生物合成工程，我们首先构建了三种bixin生物合成酶的编码质粒pUC19-LCD-BADH-nBMT。为此，将BoLCD cDNA克隆到pUC19载体的PstI和XbaI位点，获得pUC19-LCD。含有Shine-Dalgarno(SD)序列、翻译起始密码子和限制位点(XbaI、ClaI、SpeI和KpnI）的寡核苷酸

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