用同源重组法在体克隆大基因簇的平行克隆载体

Scidown文献预览系统！

作者：scidown 发布时间：2021-07-15 12:13:17 文章标题：

用同源重组法在体克隆大基因簇的平行克隆载体( Generating In Vivo Cloning Vectors for Parallel Cloning of Large Gene Clusters by Homologous Recombination )

文章作者：

J Lee E Rha SJ Yeom DH Lee ES Choi SG Lee Ribosomes Escherichia coli Hexosyltransferases Green Fluorescent Proteins DNA Genetic Markers Cloning, Molecular Transformation, Bacterial Drug Resistance, Bacterial Multigene Family

文章简述：

基于同源重组(HR)技术，建立了一种在体内克隆大基因簇的方法，该方法只需将PCR产物转化到含有受体质粒的大肠杆菌细胞中。通过将PCR产物中短的核糖体结合位点和起始密码子序列募集到受体质粒中沉默的抗生素抗性基因的上游位置，从而激活获得的抗生素抗性来筛选阳性克隆。结果表明，GFPuv基因的克隆效率与常规的限制性内切连接法相当，每μg DNA克隆4.3×10(4)个阳性克隆。当我们尝试平行克隆GFPuv融合基因（大小:2.0kb)和类胡萝卜素生物合成途径簇（大小:4kb、6kb和10kb)时，无论DNA大小，克隆效率都同样高，这表明这将有助于克隆携带多个开放阅读框的大DNA序列。然而，对所获得质粒的限制性分析表明，所选择的细胞可能含有大量没有插入物的受体质粒。为了减少阳性选择中空质粒的数量，在大肠杆菌细胞中，编码左旋蔗糖酶的sacB基因被引入受体质粒中作为反向选择标记，因为它将蔗糖转化为有毒的左旋蔗糖。因此，该方法通过将PCR产物直接转化到大肠杆菌细胞中，获得了完全均一的含有插入物的质粒。

文章下载地址（开放版）：