日本链脲平面嗜热双结构域漆酶在大肠杆菌中的表达及其对三芳基甲烷和偶氮染料的活性( Expression of thermophilic two-domain laccase from Catenuloplanes japonicus in Escherichia coli and its activity against triarylmethane and azo dyes )

Liubov Igorevna Trubitsina Azat Vadimovich Abdullatypov Anna Petrovna Larionova Ivan Vasilyevich Trubitsin Alexey Arkadyevich Leontievsky

背景双结构域漆酶是2000年初在细菌中发现的含铜氧化酶。双结构域漆酶以其热稳定性、广泛的底物特异性和最重要的是对经典真菌漆酶的强抑制剂（叠氮化物、氟化物）的抗性而闻名。低氧化还原电位被发现是所有双结构域漆酶的特异性，这使得这些酶失去了研究人员的兴趣，因为这些酶可能用于各种生物技术目的，如生物修复。寻找、获得新型双结构域漆酶并对其性质进行研究，将有助于获得高氧化还原电位的漆酶，使其具有更高的实际应用价值。方法在日本链球菌基因组中鉴定一个双结构域漆酶基因，克隆并在大肠杆菌中表达。采用固定化金属离子亲和层析法将蛋白质纯化至均一。在天然和变性条件下，用电泳法研究了其分子性质。采用分光光度法测定了漆酶的理化性质、动力学特性、底物特异性和对三苯甲烷染料的脱色能力。结果一个新的双结构域重组漆酶CjSL是一个多聚体，亚基分子量为37kDa。在碱性pH下，它能氧化多种酚类底物（阿魏酸、咖啡酸、对苯二酚、邻苯二酚等），而在酸性pH下，对非酚类底物(K4[Fe(CN)6]、ABTS)的氧化效果最好。纯化酶的紫外-可见吸收光谱对所有双结构域漆酶具有特异性，吸收峰在600 nm,肩峰在340 nm。CjSL对ABTS和2,6-DMP底物的最佳pH值分别为3.6和9.2。最适温度为70°C。该酶在中性碱性条件下最稳定。在90℃预培养60分钟后，CjSL仍保持53%的活性。即使煮沸60分钟，酶仍保持26%的活性。考察了NaF、NaN_3、NaCl、EDTA和1,10-邻菲咯啉对酶活性的影响。在酸性和碱性条件下，只有1,10-邻菲罗啉降低漆酶活性。漆酶对三苯甲烷染料和偶氮染料有较好的脱色效果。ABTS和丁香醛是有效的脱色介质。染料脱色效果取决于反应介质的pH值。

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