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利用成对gRNAs的CRISPR/AsCpf1筛选诱导中国仓鼠卵巢细胞基因组缺失( A pooled CRISPR/AsCpf1 screen using paired gRNAs to induce genomic deletions in Chinese hamster ovary cells )
Valerie Schmieder Nea Novak Heena Dhiman Ly Ngoc Nguyen Nicole Borth
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是应用最广泛的治疗蛋白表达宿主。近年来，随着基因组序列和注释质量的提高，揭开黑匣子CHO的研究取得了重大进展。然而，在许多情况下，在悬浮培养生产细胞系的背景下，基因型和表型之间的联系仍然没有完全理解。虽然以编码基因为目标的移码方法经常被使用，但基因组的非编码区在这种功能注释方面受到的关注较少。重要的是，对于非编码区域，移码剔除策略是不可行的。在这项研究中，我们开发了一种CRISPR介导的筛选方法，该方法对基因组区域进行完全缺失，从而能够对翻译和未翻译的基因组进行功能研究。建立了一个用于计算高通量设计CRISPR/ASCPF1导向的配对引导RNAs（pgRNAs）的in silico管道，并用于生成处理过程相关基因和长非编码RNAs的文库。对该质粒文库的下一代测序分析显示了一个充足但高度可变的pgRNA组成。重组酶介导的盒式交换用于pgRNA文库整合而不是病毒转导，以确保每个细胞的pgRNAs单拷贝表达。在短暂的AsCpf1表达后，细胞被连续培养两批，以确定对生长和存活有巨大影响的pgRNAs。通过比较pgRNA丰度，识别耗尽的候选基因，并对其进行单独验证，以验证其效果。
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