利用嗜热酶体外生产辅酶A( In vitro production of coenzyme A using thermophilic enzymes )

GS Alim T Iwatani K Okano S Kitani K Honda

辅酶A（CoA）是一种重要的辅助因子，存在于生命的各个领域，参与多种代谢途径，包括脂肪酸代谢、丙酮酸通过TCA循环的氧化以及次生代谢产物的产生。这种特性使CoA在制药、化妆品和临床工业中成为一种有商业价值的化合物。然而，由于CoA在多种代谢途径中消耗，难以在活细胞中高水平积累，阻碍了典型的细胞培养和提取方法的生产。CoA对生物合成酶泛酸激酶(PanK)的反馈抑制也是CoA高效生产的严重障碍。为了克服这一挑战，在体外生产CoA，在细胞外利用重组嗜热酶重建CoA生物合成途径，进行了研究。利用嗜热菌Thermus thermophilus的CoA不敏感的III型PanK设计了对CoA反馈抑制不敏感的体外途径。此外，采用实验设计的统计方法，合理地确定酶负荷比，以最大限度地提高CoA的产率。结果表明，由2 mM d-泛泰通过设计的途径可产生0.94mM CoA。我们假设转化产率不足的原因是嗜热菌PanK对ATP的K m值较高。在此基础上，研究了嗜热芽孢杆菌CoA可能的调控机制以及通过体外途径提高CoA生产可行性的途径。在细菌和真核生物中，辅酶A（CoA）的生物合成受以Ⅰ型和Ⅱ型泛酸激酶（PanK）为靶点的反馈抑制调控。III型PanK仅见于细菌，一般对CoA不敏感。以前，来自高温嗜热细菌Thermotoga maritima的III型PanK被证明不符合这一典型特征，而是显示出对CoA的抑制作用。本研究通过对嗜热菌Ⅲ型PanK的系统发育分析和功能分析，发现海洋吸虫Ⅲ型PanK对辅酶A敏感的行为是不常见的。我们从嗜热杆菌和地杆菌中克隆了III型PanKs。结果表明，这两种酶的活性均不受CoA的抑制。此外，我们利用Ⅲ型PanK进行一锅级联反应生产CoA。

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