利用多路共免疫沉淀定量蛋白质相互作用网络动力学( Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation )

Emily A. Brown Steven C. Neier Claudia Neuhauser Adam G. Schrum Stephen E.P. Smith

动态蛋白质-蛋白质相互作用控制细胞行为，从运动性到DNA复制再到信号转导。然而，监测蛋白质相互作用网络中多种蛋白质之间的动态相互作用在技术上是困难的。在这里，我们提出了一种定量多重免疫沉淀（QMI）方案，该方案允许基于通过暴露表面表位（PiSCES）检测的共享复合物中蛋白质的相对荧光测量来定量评估蛋白质相互作用的倍数变化。在QMI，来自细胞裂解物的蛋白质复合物被免疫沉淀到微球上，然后用标记的抗体探测不同的蛋白质，以量化双鱼座的丰度。免疫沉淀抗体与不同的磁珠光谱区域结合，这允许流式细胞仪区分多个平行免疫沉淀，并同时定量与每个免疫沉淀相关的探针抗体的量。QMI不需要基因标记，与其他免疫沉淀方法相比，可以使用最少的生物材料进行。QMI可以适用于任何确定的相互作用蛋白质组，迄今为止已被用于表征T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。结果导致了具有潜在诊断和治疗应用的新假设的产生。该方案包括执行QMI的说明，从最初的抗体组选择到运行分析和分析数据。QMI分析的初始组装包括筛选抗体以产生一个面板，并根据经验确定合适的裂解缓冲液。随后的试剂制备包括将免疫沉淀抗体与磁珠共价偶联，并生物素化探针抗体，以便它们可以被链霉亲和素缀合的荧光团标记。为了进行分析，将裂解物与MagBeads混合过夜，然后将珠子分开并与不同的探针抗体孵育，然后进行荧光团标记，并通过流式细胞仪读取。执行两个统计测试来识别实验条件之间显著不同的双鱼座，并使用热图或节点边缘图可视化结果。

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