端粒酶重复扩增协议(TRAP)( Telomerase Repeated Amplification Protocol (TRAP) )

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端粒位于真核生物线性染色体的末端，与端粒结合的蛋白质保护DNA不被识别为双链断裂从而防止端到端融合（Griffith等，1999)。然而，由于末端复制问题和其他因素如氧化损伤，培养细胞的有限寿命（Hayflick极限）导致这些保护性结构的渐进性缩短（Hayflick和Moorhead，1961；Olovnikov，1973)。核糖核蛋白复合酶端粒酶--由蛋白质催化组分hTERT和功能RNA组分hTR或hTERC组成--通过在90%的原发性人类肿瘤和一些瞬时增殖的干细胞染色体末端添加端粒重复序列来对抗端粒缩短（Shay and Wright，1996；Shay and Wright，2001)。这导致细胞的持续增殖，这是癌症的一个特征。因此，端粒生物学在衰老、癌症进展/转移以及肿瘤靶向治疗中起着重要作用。端粒生物学中常用的方法有端粒限制性片段(TRF)(Mender and Shay，2015b)、端粒重复序列扩增协议(TRAP)和端粒功能障碍诱导灶(TIF)分析（Mender and Shay，2015a)。在这个详细的协议中，我们描述端粒重复扩增协议(TRAP)。TRAP分析法是一种常用的测定哺乳动物细胞和组织样品中端粒酶活性的方法（Kim et al.，1994)。TRAP分析包括三个步骤：延伸、扩增和端粒酶产物的检测。在延伸步骤中，端粒重复序列被端粒酶添加到端粒酶底物（实际上是非端粒寡核苷酸，TS)上。在扩增步骤中，使用特异性引物（TS上游引物和ACX下游引物）通过聚合酶链反应(PCR)扩增延伸产物，在检测步骤中，通过电泳分析端粒酶的存在与否。TSNT为内标对照，用TS引物扩增。NT是自身的反向引物，不是端粒酶的底物。这些引物用于鉴别假阴性结果，如果凝胶缺乏内部对照带。

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