红花OleosinCT1的克隆及其表达调控研究

于洋 红花 油体蛋白基因 油体蛋白启动子 TAIL-PCR

目前,利用植物作为生物反应器生产目的产品已经在基因工程研究中取得了一些瞩目的成就,但随着研究的深入也发现了一些相关问题,例如蛋白不能达到较高的产量,在后续的分离过程出现的困难而导致成本高等现象.国内外对红花进行了大量研究,特别是油用红花受到人们的高度重视.红花油体蛋白被发现在油料作物中能够高水平的积累表达,通过这一发现,我们可以利用红花油体系统作为生物反应器,生产目的蛋白降低其生产成本,提高分离纯化效率等,因此红花油体蛋白基因的表达调控分析便成为研究的热点.启动子作为一重要元件能够决定基因调控的转录活性与特异性,其含有的顺式元件影响基因调控及特异性表达,对启动子中含有的元件预测分析以推测其表达调控特性已经成为红花油体蛋白基因表达调控研究的重中之重.本实验以红花转录组测序数据为基础,通过生物信息学分析获得了表达量较高的OleosinCT1片段,利用PCR方法以红花基因组为模板分离并克隆了OleosinCT1全长片段,片段长度为594bp,利用TAIL-PCR方法扩增到了红花OleosinCT15 侧翼序列及启动子序列,并验证了红花OleosinCT1启动子序列,启动子片段长度为1023bp.通过荧光定量PCR方法对红花OleosinCT1在红花花后5d,10d,15d,20d,25d,30d后不同发育时期的种子中的表达量进行了分析.根据已获得的红花Oleosi nCTl启动子序列,构建了红花OleosinCT1启动子和含有GUS基因表达载体pBAST-Pgus-OleosinCT1,利用Floral-Dip法转化拟南芥.通过以上研究,为在植物种子中特异性表达外源基因提供新的启动子,对红花OleosinCT1表达调控特性有了初步了解及推测,为红花油体蛋白基因表达分析的深入研究提供了理论基础.主要研究结果如下: 1.利用PCR方法在红花基因组中分离并克隆了红花OleosinCT1片段.验证了OleosinCT1全长片段长度为594bp.通过对红花OleosinCT1与其它十六种植物油体蛋白基因同源性系统树分析表明,OleosinCT1与向日葵具有很高的同源性,同源性高达55%. 2.利用TAIL--PCR法获得了红花OleosinCT15 侧翼序列及启动子序列,启动子片段长度为1023bp.对启动子序列进行预测分析,发现该启动子除了具有启动子基本元件外,还具有脱落酸响应元件ABRE等. 3.通过荧光定量PCR方法对红花油体蛋白基因OleosinCT1在红花花后5d,10d,15d,20d,25d,30d后不同发育时期的种子中的表达量进行了分析,确定了以18srRNA为内参基因,最佳温度为60℃等重要参数的研究系统.分析结果显示红花油体蛋白基因在种子花后5d时开始表达,花后5d-20d时表达量呈递增趋势,花后20d时表达量达到峰值,花后20d-30d时表达量呈下降趋势,红花油体蛋白基因OleosinCT1的表达水平在种子不同发育时期呈现先递增至最大值然后递减的趋势变化. 4.成功构建了红花油体蛋白基因OleosinCT1启动子和GUS基因为报告基因的植物表达载体,此载体命名为pBaster-PGUS-OleosinCT1,通过冻融法转化农杆菌,获得农杆菌菌株,通过Floral-Dip法转化拟南芥,收获拟南芥T1代种子.

SciDown文献求助系统（解决99%问题） Public Download 知网