利用DNA复制子和CRISPR/Cas9对六倍体小麦进行高效基因打靶( High-efficiency gene targeting in hexaploid wheat using DNA replicons and CRISPR/Cas9 )

J Gil-Humanes Y Wang Z Liang Q Shan CV Ozuna S Sánchez-León NJ Baltes C Starker F Barro C Gao CRISPR/Cas9 multiplexed gene targeting genome editing homologous recombination DNA replicons Wheat technical advance

通过基因打靶(GT)编辑植物基因组的能力需要高效的方法将序列特异性核酸酶（SSNs）和修复模板同时输送到植物细胞。这通常是利用农杆菌T-DNA、生物分子生物学或通过将核酸酶编码盒和修复模板稳定地整合到植物基因组中来实现的。在双子叶植物中，如烟叶（烟草）和番茄茄（番茄），使用基于DNA病毒的复制子可以使GT频率提高10倍以上。这些复制子在植物细胞中瞬时扩增至高拷贝数以传递丰富的SSNs并修复模板以实现靶向基因修饰。在本工作中，我们利用小麦矮病毒(WDV)的解构版本，建立了一个基于复制子的谷类作物基因组工程系统。在小麦细胞中，与非复制对照相比，复制子的报告基因表达量增加了110倍。此外，携带CRISPR/Cas9核酸酶和修复模板的复制子在内源性泛素位点上以比非病毒递送方法高12倍的频率实现GT。使用强启动子表达Cas9是获得这些高GT频率的关键。我们还证明了在六倍体小麦基因组的所有三个同源等位基因(A，B和D）中通过同源重组(HR)进行基因靶向整合，并且我们表明利用WDV复制子可以在同一小麦细胞内以~1%的频率实现GT的复用。总之，使用基于WDV的DNA复制子的高频率GT将使编辑复杂的谷物基因组成为可能，而不需要将GT试剂整合到基因组中。2016年作者《植物杂志》，2016年John Wiley&Sons Ltd.

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